تشخیص‌ آزمایشگاهی بروسلوز

هر دانشجویی در ایران این جمله را شنیده است که اگر کسی با هر گونه درد مفصلی به شما مراجعه کرد، فارغ از سن یا جنس، به بروسلوز فکر کنید.

با توجه به شیوع این بیماری در کشورمان، این توصیه کاملاً قابل درک است.

بروسلا دغدغه‌ی کشور ماست؛ اما در بسیاری از کشورهای جهان اول، در کتب مرجع پزشکی به آن کمتر پرداخته شده است.

به همین خاطر سعی می‌کنیم در چندین نوشته این بیماری مرموز را مورد بحث قرار دهیم.

در ادامه به تشخیص آزمایشگاهی باکتری بروسلا می‌پردازیم.

تشخیص بروسلوز به علل مختلف دشوار است. از طرفی علائم و نشانه‌های بروسلوز بسیار متنوع و غیراختصاصی هستند.

به خاطر این علائم گسترده و نبودن نشانه‌ی پاتوگنومونیک، تشخیص قطعی بروسلوز بدون روش‌های آزمایشگاهی مقدور نیست.

اما با وجود وابسته بودن به آزمایشگاه تست مشخص و کاملاً دقیقی نیز برای این بیماری وجود ندارد.

پیچیدگی و تنوع تست‌های تشخیصی این بیماری و ابهام های موجود در تفسیر بالینی نتایج آن‌ها، تشخیص این بیماری را دشوارتر می‌کند.

قبل از این‌که به روش‌های اندازه‌گیری آنتی‌بادی و جزئیات آنها بپردازیم، لازم است مختصری در مورد ایمونولوژی بیماری بروسلوز صحبت کنیم.

زیرا تشخیص بروسلوز چند فرق عمده با دیگر بیماری‌های عفونی دارد که درک آن با دانستن ایمونولوژی بیماری،‌ بهتر صورت می‌گیرد.

پاسخ ایمنی به بروسلا

ایمنی ذاتی

ایمنی ذاتی از بدو ورود این میکروب به بدن (از پوست آسیب دیده یا مخاطات) وارد عمل می‌شود.

فاگوسیتوز و کشتن داخل سلولی بروسلا از جمله کارکردهای ایمنی ذاتی در مقابله با این ارگانیسم است.

بروسلا همانند مایکوباکتریوم‌ها و لیستریا یک باکتری داخل سلولی است و مکانیسم‌های مشابهی برای فرار از ایمنی ذاتی دارد (مقاومت در برابر کشته شدن داخل لیزوزوم‌های فاگوسیت‌ها).

اگر فاگوسیت‌ها قادر به کنترل و ریشه کنی عفونت شوند، بیماری بروسلوز ایجاد نخواهد شد و در این شرایط گفته می‌شود فرد مقاومت ذاتی به بروسلا دارد.

مقاومت ذاتی به برخی سویه‌های بروسلا در مطالعات حیوانی گزارش شده است؛ ولی اهمیت این پدیده در انسان روشن نیست.

در مواردی که ایمنی ذاتی قادر به کنترل عفونت نباشد، مکانیسم‌های بدن برای مقابله با بروسلا مشابه سایر باکتری‌های داخل سلولی است (فعالسازی ماکروفاژ توسط لنفوسیت‌های T و تشکیل گرانولوم).

ایمنی هومورال و ایجاد آنتی بادی ضد بروسلا

آنتی‌ژن اصلی بروسلا که علیه آن آنتی‌بادی ترشح می‌شود، مولکول لیپوپلی‌ساکارید (lipopolysaccharides یا LPS) است. ساختار LPS بروسلا شبیه LPS به شکل کلی شبیه باکتری‌های گرم منفی دیگر است؛ اگرچه عملکرد اندوتوکسینی آن ضعیف‌تر است.

روش‌های سرولوژی رایج همین آنتی‌بادی را اندازه می‌گیرند و علت وجود نتایج مثبت کاذب در آن‌ها، تشابه مولکول LPS بروسلا با سایر باکتری‌های گرم منفی است.

تعدادی از این باکتری‌ها که با واکنش متقاطع (cross reaction) می‌توانند سرولوژی مثبت بروسلا ایجاد کنند، عبارتند از:

• E. coli O:157
• Yersinia enterocolitica O:9
• Salmonella O:3
• Francisella tularensis
• Vibrio cholera
  • حتی سرولوژی بروسلا ممکن است با واکسن وبا نیز مثبت بشود.

شروع بیماری بروسلوز در حدود نیمی از موارد حاد و با دوره کمون حدود ۲ الی ۳ هفته‌ای است. در نصف دیگر موارد، بیماری بروسلوز بصورت تحت حاد و آهسته، در عرض هفته‌ها و ماه ها بعد از عفونت خود را نشان می‌دهد.

در اولین هفته ایجاد عفونت، آنتی‌بادی ترشح شده علیه بروسلا از نوع IgM است. با تداوم بیماری و از هفته دوم عفونت، IgG و IgA هم ترشح می‌شود (در نتیجه‌ی پدیده class switching).

با مزمن شدن عفونت بروسلا، تیتر IgG و IgA بیشتر از IgM خواهد شد و در موارد مزمن و طول کشیده غلبه با IgG و IgA بوده و تیتر IgM اندک است. در مواردی که عفونت بسیار طولانی شود IgGهایی که فاقد خاصیت آگلوتیناسیون هستند غلبه پیدا کرده و ممکن است تست رایت بصورت کاذب منفی گزارش شود.

ایمنی سلولی

ایمنی سلولی به واسطه لنفوسیت‌های T به عنوان مکانیسم اصلی مقابله بدن با بروسلا شناخته می‌شود.

اینترفرون گاما که از سلول T-helper 1 ترشح می‌شود، با فعال کردن ماکروفاژها کشتن داخل سلولی بروسلا را تسهیل می کند.

همانند TB، در بروسلوز هم ازدیاد حساسیت تأخیری (نوع ۴) به آنتی‌ژن‌های پروتئینی بروسلا ایجاد می‌شود که می‌توان با تزریق اینترادرمال، این پروتئین‌ها بررسی کرد.

این پاسخ همان‌گونه که از اسمش پیدا است، مدت‌ها بعد از ایجاد آنتی‌بادی به وجود آمده و تا ماه‌ها بعد از کاهش تیتر آنتی‌بادی باقی می‌ماند.

برخلاف TB، از این روش برای تشخیص عفونت بروسلا یا بیماری بروسلوز استفاده نمی‌شود.

کشت و روش‌های مولکولی در تشخیص بروسلوز

حساسیت کشت برای تشخیص بروسلوز بین ۱۵ تا ۷۰٪ است.

در کشور‌های با منابع محدود، محیط کشت‌های دوفازی یا بای‌فازیک (دارای جزء مایع و جامد) مثل محیط کاستاندا (Castaneda) برای کشت استفاده می‌شود. محیط کشت بای‌فازیک به حدود ۶ هفته انکوباسیون نیاز دارد. علاوه بر این در عفونت مزمن، کشت معمولاً منفی است.

اکثر کشت‌ها ظرف ۷ الی ۲۱ روز مثبت می‌شوند؛ اما در صورت عدم رشد، محیط کشت تا ۴ هفته باید در انکوباتور باقی بماند.

در سیستم‌های جدیدتر کشت مثل BACTEC، در ظرف حدود سه روز می‌توان بروسلا را از محیط جداسازی کرد. در این محیط‌های پیشرفته نیازی به انکوباسیون بیشتر از یک هفته نیست. در صورت استفاده از بافت‌های دیگر برای کشت (غیر از خون)، شاید تا سه هفته نیز در انکوباتور باقی بمانند.

برای تشخیص بروسلا، استاندارد طلایی (gold standard) کشت مغز استخوان است. کشت مغز استخوان این مزیت را نسبت به کشت خون دارد که باکتری زودتر کشف می‌شود و هم‌چنین حساسیت آن با دریافت درمان آنتی‌بیوتیکی نیز تغییری نمی‌کند.

از روش‌های مولکولی مثل PCR هم می‌توان برای تشخیص بروسلوز استفاده کرد و در کشور ما نیز انجام می‌شوند. اما چون این روش‌ها نمی‌توانند بین بیماری فعال و عفونت مزمن افتراق دهند، صرفاً زمانی استفاده می‌شوند که تست‌های سرولوژی منفی باشد و به بیماری شک داشته باشیم.

هر چند در برخی از افراد – به علت نامعلوم – PCR حتی بعد از درمان موفق مثبت باقی می‌ماند.

سرولوژی در بروسلوز

روش‌های مبتنی بر آگلوتیناسیون

اولین روش سرولوژی برای تشخیص بروسلوز، استفاده از باکتری‌های کشته شده توسط فنول به منظور تشخیص آنتی‌بادی‌های موجود در سرم فرد مبتلا به بروسلوز است.

آنتی‌بادی‌های سرم با آنتی‌ژن LPS واکنش داده و ایجاد آگلوتیناسیون می‌کنند و به همین علت نام مرسوم این تست “serum agglutination test” یا SAT است.

این روش توسط Wright و Smith در سال ۱۸۹۷ ابداع شده و علی‌رغم محدودیت‌هایی که دارد، هنوز استاندارد تشخیص سرولوژیک بروسلا محسوب می‌شود.

در کشور ما این تست به نام تست رایت معروف است.

حداقل ۲ تست دیگر هم بر مبنای آن ساخته شده که به توضیح آن‌ها نیز خواهیم پرداخت و در ادامه این سه تست را بررسی می‌کنیم.

بروسلا کانیس بر خلاف بروسلا ابورتوس، ملی‌تنسیس و سوئیس، فاقد آنتی‌ژن‌های A و M بوده و با تست آگلوتیناسیون معمول قابل شناسایی نیست.

تست رایت (Wright) یا SAT

به طور استاندارد با استفاده از آنتی‌ژن بروسلا، آگلوتیناسیون در لوله‌هایی با رقت‌های متفاوت سرم انجام می‌شود.

انجام تست و گزارش آن به حداقل ۲۴ ساعت زمان نیاز دارد.

ولی می‌توان به جای استفاده از لوله، با انجام تست روی یک لام در زمانی کوتاه‌تر (۱۰ دقیقه) نتیجه گرفت (اگرچه که حساسیت پایین‌تری خواهد داشت). این آزمایش به Rose Bengal test معروف است.

تست رایت تمام انواع آنتی‌بادی آگلوتینه‌کننده را اندازه می‌گیرد؛ ولی قادر به افتراق آن‌ها نیست.

فراموش نکنیم که قسمتی از آنتی‌بادی‌های ضد بروسلا (به خصوص در موارد عفونت مزمن) فاقد خاصیت آگلوتیناسیون هستند، توسط این تست تشخیص داده نمی‌شوند. به همین دلیل تست رایت منفی ردکننده‌ی بیماری نیست.

یک خطای دیگر که در انجام این تست ممکن است رخ دهد پدیده prozone است که به دلیل عدم تناسب بین آنتی‌بادی و آنتی‌ژن به وجود می‌آید. این پدیده را در درس Hook Effect به تفصیل توضیح خواهیم داد. با انجام تست در رقت‌های بالاتر این عدم تناسب رفع شده و آگلوتیناسیون رخ می‌دهد.

تیتر ۱:۱۶۰ در اغلب منابع به عنوان تیتر مثبت تلقی می‌شود. در تست رایت از آنتی‌ژن بروسلا ابورتوس استفاده می‌شود؛ ولی در ایران اغلب بیماران مبتلا به عفونت با بروسلا ملی‌تنسیس هستند. به همین خاطر تیتر مثبت در ایران را پایین‌تر در نظر می‌گیریم و ۱:۸۰ را نیز مثبت تلقی می‌کنیم.

تست Coombs Wright

برخی از آنتی‌بادی‌های IgA در بروسلا به وجود می‌آیند که در آگلوتیناسیون آنتی‌بادی‌های IgG و IgM تداخل ایجاد می‌کنند. به این آنتی‌بادی‌ها، Blocking Antibody یا آنتی‌بادی بلوکان می‌گویند.

علاوه بر این در عفونت مزمن بروسلا آنتی‌بادی‌های غیر آگلوتینه‌کننده (عمدتاً از نوع IgG) غلبه پیدا می‌کنند و به همین علت ممکن است تست رایت منفی باشد.

این آنتی‌بادی‌ها معمولاً در فاز تحت حاد (subacute) پدیدار می‌شوند. برای خنثی کردن اثر این آنتی‌بادی‌های بلوکان می‌توانیم از کومبس رایت استفاده کنیم.

مثال کاربرد شایع و مهم این تست زمانی است که مثلاً یک دامدار از منطقه‌ی اندمیک برای بروسلا، با تب و تعریق زیاد و کمردرد مراجعه کرده است و علیرغم شک بالینی بسیار قوی برای عفونت بروسلا، تست رایت منفی گزارش می‌شود. در این زمان شک می‌کنیم که نکند آنتی‌بادی بلوکان وجود داشته باشد.

در این شرایط با استفاده از واکنش‌گر کومبس یا anti-human antiglobulin می‌توانیم فرایند آگلوتیناسیون را بهبود ببخشیم و سپس مشابه تست رایت انجام را دهیم. این تست شبیه به کومبس غیرمستقیم در بررسی وجود آنتی‌بادی ایجادکننده‌ی همولیز است.

برای انجام این تست به ۲۴ ساعت دیگر نیاز داریم و در نتیجه، جواب نهایی پس از ۴۸ ساعت آماده می‌شود.

تیتر آنتی‌بادی‌های این آزمایش، به علت شناسایی طیف گسترده‌تری از آنتی‌بادی، به خصوص در عفونت مزمن، بسیار بالاتر از روش رایت است؛ به‌طوری که در عفونت حاد ۴ الی ۱۶ برابر و در عفونت مزمن ۱۶ الی ۲۵۶ برابر بیشتر است.

لازم به ذکر است تست کومبس رایت تا سال‌ها بعد از بهبودی یا درمان مثبت باقی می‌ماند و ارزشی در پیگیری بیماران ندارد.

برای کومبس رایت تیتر ۱:۴۰ را مثبت در نظر می‌گیریم.

تست 2ME

بیماری را در نظر بگیرید که یک‌بار با علائم بالینی مطابق با بروسلا و تست رایت مثبت با تیتر ۱:۱۶۰ با موفقیت درمان شده است و هم اکنون با شکایت از کمردرد مراجعه کرده است. از کجا بدانیم بیماری عود کرده است یا نه؟

شاید اگر بیماری عفونی دیگری بود، دوباره تست IgM درخواست می‌دادیم. اما در بروسلا، به سه علت به سراغ IgG می‌رویم:

• در تعدادی از بیماران، حتی پس از درمان موفق ممکن است IgM مثبت باقی بماند. به همین خاطر بعد از درمان موفق آنتی‌بیوتیکی هم، تست رایت می‌تواند حتی تا ۲ سال مثبت باقی بماند. در نتیجه تست رایت برای افتراق بین عفونت قبلی بروسلا و عود آن مناسب نیست.
• هم‌چنین کسانی که دائماً با باکتری بروسلا در تماس هستند (مثلاً کارگران کشتارگاه)، به دلیل گذشت زمان قابل توجه از مراحل اولیه بیماری، دیگر انتظار نمی‌رود که IgM بالایی داشته باشند.
• در مواردی که بهبودی صورت گیرد و سپس عود (relapse) اتفاق بیفتد، تیتر IgG و IgA (و نه IgM) بالا خواهد رفت.

در بروسلا از IgG برای تشخیص فاز فعال، فاز مزمن و پاسخ به درمان استفاده می‌کنیم.

تست رایت قادر به افتراق بین انواع آنتی‌بادی نیست. در نتیجه می‌توانیم از تست 2ME استفاده کنیم.

۲-مرکاپتو اتانول (2ME) پیوندهای دی‌سولفیدی بین مولکول‌های IgM و هم‌چنین IgA را شکسته و فعالیت آگلوتیناسیون این دو نوع آنتی‌بادی را از بین می‌برد.

برای مثال اگر برای کسی تست رایت انجام دادیم و با رقت ۱:۱۶۰ مثبت شد و پس از اضافه کردن 2ME، عیار تست به ۱:۱۰ رسید، یعنی تقریباً تمام مولکول‌های موجود از نوع IgM بوده است. اما اگر پس از اضافه کردن 2ME عیار تست همان ۱:۱۶۰ باقی بماند، یعنی همه‌‌ی آنتی‌بادی‌ها از نوع IgG است.

بنابراین انجام مجدد تست رایت بعد از اضافه کردن 2ME فقط تیتر IgG را نشان می‌دهد.

در صورت منفی شدن آن پس از یکبار مثبت بودن، یعنی بیماری فعال نیست و این به نفع درمان موفق است.

کاربرد دیگر تست 2ME در تشخیص موارد مثبت کاذب تست رایت است؛ واکنش متقاطعی که با سایر باکتری‌های گرم منفی رخ می‌دهد عمدتاً منجر به تولید IgM می‌شود. با کمک تست 2ME میتوان تا حدی این مسئله را مورد بررسی قرار داد.

برای 2ME تیتر ۱:۴۰ را مثبت در نظر می‌گیریم. همان‌طور که راهنمای کشوری بروسلوز می‌گوید، سودمندترین تست سرولوژی برای بررسی پاسخ درمانی، عیار تست 2ME است.

روش ELISA

در مقابل روش‌های مبتنی بر آگلوتیناسیون که تمام کلاس‌های آنتی‌بادی (IgG, IgM, IgA) را اندازه می‌گیرد، در روش ELISA میتوانیم هر کلاس آنتی‌بادی را به طور جداگانه اندازه بگیریم.

همچنین تعدادی از آنتی‌بادی‌های مترشحه خاصیت آگلوتینه‌کنندگی ندارند و به همین دلیل فقط به کمک روش ELISA قابل اندازه گیری هستند.

برای اندازه‌گیری IgG، الایزا تست مناسبی است و می‌تواند جایگزین کومبس رایت و 2ME شود. زیرا الایزا علاوه بر آگلوتینین‌ها، می‌تواند IgG های غیر آگلوتینین را هم اندازه بگیرد (برخلاف 2ME و کومبس رایت).

پس همانند تست 2ME، با ELISA هم می‌توان مواردی را که بهبودی و سپس عود اتفاق افتاده و تیتر IgG و IgA (و نه IgM) بالا رفته است، تشخیص دهیم.

جای دیگری که روش ELISA ارجحیت دارد در تشخیص نوروبروسلوز است؛ وجود آنتی بادی ضدبروسلا در CSF حاکی از درگیری CNS است.

سیر آنتی‌بادی‌ها پس از ازمان یا درمان

یک موضوع دیگر که به پیچیدگی بروسلا اضافه می‌کند، نتایج متفاوت بین الایزا و تست رایت است. با توجه به این‌که این پیچیدگی‌ها در سطح این نوشته نیستند، ما نیز وارد این موارد نمی‌شویم و با جمع‌بندی زیر، این قسمت را به پایان می‌رسانیم.

مثبت کاذب و منفی کاذب

ممکن است در اوایل عفونت، در فرد با سیستم ایمنی سرکوب‌شده و در هنگام وجود آنتی‌بادی‌های غیرآگلوتینه‌کننده یا بلوک‌کننده، تست منفی کاذب باشد.

هم‌چنین پدیده prozone نیز ممکن است منجر به منفی کاذب شود. بروسلا کانیس نیز در روش رایت قابل تشخیص نیست.

در هنگام عفونت با باکتری‌هایی مثل Francisella tularensis و Yersinia enterocolitica و Escherichia coli و Salmonella urbana و Vibrio cholerae نیز، تست مثبت کاذب می‌شود. واکسن وبا نیز می‌تواند مثبت بکند. این واکسن جزئی از واکسیناسیون روتین کشور ما نیست.

رویکرد تشخیصی آزمایشگاهی

بر اساس کرایتریای تشخیصی CDC/CSTE تشخیص قطعی بروسلوز با یکی از دو روش زیر است:

1. کشت ارگانیسم از خون، بافت (کبد یا مغز استخوان) و سایر مایعات بدن (ادرار، مایع مغزی نخاعی، مایع سینوویال و مایع پلورال): این روش رایجی نیست. هم‌چنین بروسلا از جمله ارگانیسم‌هایی است که در جریان کار با نمونه‌ها جهت انجام کشت می‌تواند به کارکنان آزمایشگاه هم منتقل شود.
2. افزایش ۴ برابر یا بیشتر تیتر آنتی‌بادی ضد بروسلا در دو نمونه که با فاصله حداقل ۲ هفته از هم گرفته شده باشد.

شکست درمان و عود	عفونت مزمن / موضعی	عفونت حاد	نام تست
–	−/+	✓	رایت
–	✓	✓	کومبس رایت
✓	✓	−/+	2ME